Técnicas Histológicas

 

Son los procedimiento empleados para analizar un organismo y sus caracterisiticas microscópicas con ayuda del microscopio

Para su relización se deben cumplir ciertos pasos los cuales son

1. Obtención de muestra
2. Fijación
3. Lavado
4. Obtención de corte
5. Tinción
6. Observación al microscopio

1 Obtención de muestra
Biopsia: Es la extracción de un muestra de tejido  de un ser vivo para ser analizada al microscopio

Clasificación

Esta técnica puede obtenerse una muestra de dos maneras por incisión y excisión

Incisión: Solo tomar una parte del tejido dañado

Excisión: Tomar o retirar todo el tejido dañado

Tipos

Asi mismo  existe diferentes tipos de biopsia

Endoscópica: Introducir una cámara por vía oral  para revisar la morfología de los órganos

Médula ósea: Extracción de tejido de vertebras, esternón o de los iliacos

Perforación: Es una perforación de hueso

Raspado: También se realiza en el hueso pero haciendo un raspado

Punción: Introducir una aguja en un vaso sanguíneo para extraer una muestra de tejido (sangre)

Aspirado: Extracción de muestra líquida por medio de una succión, se emplea en caso de trastornos alimenticios pues sirve para diagnosticar anemia megaloblástica o cuando hay sospechas de leucemia (cáncer de sangre)

Aquí se usa una aguja llamada aguja de mandril que tiene la capacidad de  atravesar piel, musculo y hueso

Con el se puede hacer un frotis

Impronta: Estudios citológicos  que permite la visualización de células sanguíneas, consiste en frotar el tejido o muestra sobre portaobjetos logrando asi separar y aislar las células, para su observación al microscopio

2 Fijación

Es el detenimiento de toda actividad celular para mantener todas las estructuras morfológicas sin cambios y asi todo lo que se vea, sea normal

Si no se hiciera podría la muestra recibir de daños como:

Autolisis: Destrucción de células por  acción enzimática causadas por las propias células y sin acción bacteriana

Putrefacción: destrucción de tejidos  por acción bacteriana

Tipos de fijación

Fijadores Físicos

Calor: Consiste en pasar un portaobjetos por el fuego y para que las bacterias no puedan adherirse

Congelación: Sirve para muestras de obtención rápida

Fijadores químicos

Son todos aquellos que su origen sea químico (reactivos)

Fijación por coagulación de proteínas: Mantienen la morfiología y las grasasEl ejemplo mas comun es el formaldehido

Fijación por precipitado de proteínas: Este tipo de método causa artefactos que afecta la observación al precipitarse forma un cúmulo sobre células generando  un mazacote anormal que se ven  como manchas y evita la observación de los nucléolos

Clasificación de fijadores químicos

Se clasifican en fijadores simples y compuestos

Simples

Son todos aquellos que están conformados por un solo fijador

 Ejemplos

• Formaldehido al 10%
• Alcohol etílico 
• Metanol
• Tetróxido de osmio
• Bicloruro de mercurio

Compuesto

Mezcla de 2 o mas fijadores químicos simples

Ejemplos

• Bouin*
• Zenker
• Flemming*
• Helly
• Heidenhein*

* Los mas usados

Cualidad de los fijadores

• Actuan con rapidez
• No crean artefactos (coagulador de proteínas)
• Tienen poder de penetración y difusión 
• Producen dureza sin hacer quebradiza o retrae la muestra
• No interfiere en la coloración  u otros pasos de la técnica histológica
• No debe ser tóxico 
• Debe ser económico

Criterios

• Tamaño de la muestra: 2 cm x 5 mm  de espesor
• Volumen fijador que abarque 10 veces la muestra
• Tiempo de fijación de 1 semana como mínimo
• Temperatura de la fijación
• Almacenamiento de la muestra

3 Lavado del fijador

Se lava con agua para quitar la grasa y se suspende en un vaso, el agua no debe ser a mucha presión

4 Obtención de corte

4.1 Congelación

4.2 Inmersión en parafina

4.1 Congelación 

Se realiza con ayuda de un criotomo un aparato que tiene la capacidad de realizar cortes finos

Procedimiento

Para congelarse requiere de algun material que ayude a su congelamiento entre los que puede estar

• Anhídrido carbónico comprimido
• Isopentano
• Dióxido de carbono

A una temperatura de entre -20 y 30°C

Propiedades

• Conserva lípidos, proteínas (como las enzimas)
• Cortes gruesos (de entre 20 a 30 micras)
• No se usa para morfología sino para ver el tejido de la muestra
• Es una técnica rápida
• Hace cortes completos o no seriados

Criostato

Es un aparato que se podría decir tiene un criotomo adentro, es la evolución del criotomo, es por eso que es el que se usa en laboratorios de patología 

El criotomo tiene como desventaja el generar cristales los cuales rasgan los tejidos además de que dichos cristales son visibles en el microscopio, es por eso que el criostato tiene una sustancia crioprotectora que evita la formación de estos cristales (la sustancia puede ser isopentano o anhídrido  carbónico

También es posible obtener cortes de 2 micras de grosor

Ventajas

• Conserva lípidos, proteínas y enzimas
• Utiliza poco material
• Es de rápido diagnóstico
• Es barato
• No requiere fijador
• Facil de manipular  el grosor
• Requiere poco material
• Tiene muchas veces una navaja permanente que debe dársele mantenimiento
• Utiliza materiales no tóxicos

Desventajas

• No se conserva la morfología microscópica
• (En el criotomo) genera cristales que rasgan las células
• Cortes no seriados, lo cual hace imposible detectar el nivel de daño en los tejidos
• Son preparaciones temporales

4.2 Inclusión en parafina

Para su realización se requiere de un microtomo

Se usa la parafina para que la muestra adquiera dureza y asi poder hacerle cortes

Procedimiento

1. Deshidratación
Quitar el agua que contiene con ayuda de diferentes concentraciones de alcohol
Sumergir alcohol 
a) Al 50% por 2 horas
b) Al 60% por 2 horas
c) Al 70% por 2 horas
d) Al 80% por 2 horas
e) Al 96 % por 2 horas
f) Absoluto (100%) por 2 horas
g) Alcohol  absoluto con Xilol por 2 horas
Este procedimiento se hace con la finalidad de que se vayan adaptando las células y no sufran cambios bruscos

Impregnar en un solvente de parafina (xilol)
Se pone en una solución xilol por otras 2 horas
Observación: El xilol es una sustancia cancerígena  tóxica y con olor penetrante
Los órganos se van a volver translucidos y permitirá que la parafina entre en contacto con las células
Inclusión en parafina (preliminar) 
La parafina se encuentra normalmente en estado sólido, y como se requiere usar en un estado líquido esta se manda a fundir, es por esto y otras razones que se hace uso de una estufa que esta a 60°C



En esta estufa se encontraran 4 recipientes de aluminio rotulados como Parafina 1, Parafina 2 parafina 3 y parafina de inclusión
La muestra se pondra sobre Parafina 1 durante 2 horas, luego en Parafina 2, Parafina 3  y parafina de inclusión sucesivamente por 2 horas en cada recipiente  

       4. Inclusión definitiva de parafina

Con ayuda de una solución de alcohol con glicerina en cantidades iguales, con una gaza se sumerge en esta solución y se barniza las paredes del molde (las pinzas con las que se debe tomar la gaza deben estar calentadas.

Luego de haber puesto la parafina 3 en el de inclusión y de haber esperado el tiempo adecuado se pone la parafina en el molde hasta la mitad, posteriormente se pone la muestra y terminar d exponer parafina hasta el borde y se deja solidificar por 10 minutos o se pueden poner sobre una cubeta de agua para acelerar su solidificación

Histokinet

Es un equipo automatizado con recipientes  de metal y vidrio en donde van soluciones de alcohol para deshidratar la muestra

En los de metal son los que se usan para fundir la parafina

Caracteristicas de la técnica de corte

• Cortes seriados
• Destruye los lípidos, ya que estos se disuelven en el alcohol
• Se debe usar un portaobjetos como sostén de la muestra y para adherirlo a este debe de hacerse un baño de flotación  de tejido a 15-20°C
• Se puede usar grenetina o albumina como pegamento
• Se le ponen gotas de xilol y se sumerge
• Se escurre el exceso
• Se pone en charola  para seca y luego en una canastilla
• Y llevarla nuevamente al horno de 60°C por 4 horas para quitar el sobrante de parafina
• Se sacan las laminilla a enfriar y se guardan en una caja de portaobjetos

Ventajas

• Cortes finos
• Permanente
• Mejor diagnostico
• Conserva proteínas y enzimas
• Cortes seriados
• Navajas desechables
• Preparación permanente

Desventajas

• Muy tardado 
• No conserva lípidos
• Reactivos tóxico y caro
• Manipulación compleja
• Antes de teñirse debe desparafinarse por 30 minutos

Conclusión

Si se quiere ver la morfología debe de  usarse parafina, pero si se quieren ver lípidos o proteínas se usa congelación

5. Coloración

Procedimiento en el que se le da color a través de una sustancia llamada colorante. Estas sustancias tienen la capacidad de fijar estructuras de los tejidos  y permite distinguir  estructuras invisibles o de poca visibilidad

Clasificación

Origen:

  Naturales, proviene de una fuente natural

         >Vegetal 

         >Animal

  Artificiales, colorante de síntesis química derivados de anilina

Para hacer una coloración se recurre a un tren de coloración el cual es una fila de reactivos acomodados en su orden de uso para la realización de la tinción, y estos están sobre un mantel blanco

Colorante

Son sales formadas por un cromógeno y un auxocromo

El cromógeno es el que aporta el color según sea la carga (+) o (-), si el cromógeno es de carga (+) teñirá estructuras de carga (-)  como el núcleo (ADN, ARN, glicosaminoglicanos), pero si es de carga (-)  teñirá estructuras de carga (+) como la estructuras protectoras o citoplasma

Por otro lado el auxocromo es que facilita la unión del cromógeno con el tejido, sin auxocromo no hay tinción

Tipos de colorantes

Básicos o nucleares

Cromógeno de carga(+) que tiñen estructuras de carga (-)

La hematoxilina es un colorante básico, por eso es capaz de
 teñir los núcleos pues estos son de carga negativa

Ácidos o citoplasmáticos

Cromógeno de carga (-) que tiñe estructuras de carga (+), requiere colorante de contraste

El citoplasma de las células epiteliales es de carga positiva

Neutros

Cromógenos con cargas positivas y negativas, con capacidad  para aportar color 

La tinción de Wright es un ejemplo

Indiferentes

Son aquellos que no son ni ácidos ni bases  y no se unen a los elementos de los tejidos por afinidad química sino que se disuelven en ellos

Clasificación de los colorantes

Topográficas:  Teñido intenso  del núcleo y débil del citoplasma o fuerte fuerte coloración en ambas

La técnica hematoxilina eosina es un ejemplo

Directa: Por inmersión  en el colorante, con solo añadir una gota de colorante es suficiente para teñirse por su afinidad  estructura-colorante (auxocromo)

La eosina es un ejemplo de este tipo

Indirecta: No hay afinidad  entre el tejido y el colorante (ausencia de auxocromo), es por eso que debe  tratarse  con un mordente el cual hace la función de auxocromo. Por lo general se usa el tritrocloruro férrico

Progresivas: Cuando el tejido  adquiere lenta y gradualmente el grado de color adecuado, es  decir, se va tiñendo poco a poco

La hematoxilina-eosina entra en esta categoría igual

Regresivas: El corte sobre teñido debe sufrir una diferenciación, cuando se utiliza un colorante por lo general tiñe todas le estructuras, es por eso que deben de usarse ciertas sustancias  (soluciones ácidas o alcohólicas) que eliminen el colorante excedente de las estructuras en las que no debería estar, estas soluciones generalmente dan otra coloración y es por eso que debe dársele otra tinción

En la tinción de hematoxilina-eosina primero se pone la hematoxilina y posteriormente de la hace una diferenciación para asi pasar a usarse la eosina

Ortocromáticas: Son las que toman el color del colorante

Metacromáticas Son las que toman un color diferente al colorante

En algunos tejidos como el cartílago cuando se usa técnica de azul de toluidina las células son capaces de alterar las frecuencias de onda del colorante adoptando asi otros colores

Procedimiento para tinción hematoxilina eosina

1. Desparafinar
Se pone en xilol 5 minutos
Se trasporta la muestra en alcohol absoluto con xilol por otros 5 minutos
2. Hidratar
Introducir la muestra en alcohol absoluto otros 5 minutos
Pasar a alcohol del 96% nuevamente por 5 minutos
Colocar en alcohol del 70% (5 minutos)
Hidratar en agua corriente (mínimo 5 minutos)
Tinción
teñir con 3 gotas de hematoxilina de Harris y dejarlo por 5 minutos
Lavar la muestra por inmersión en agua
Diferenciar con alcohol acido. Dejarlo hasta notar que la muestra se torna de naranja y retirarlo rápida e inmediatamente
Lavar con agua otra vez
Se debe virar el pH con agua amoniacal, dejándolo hasta que se vea la muestra de color azul
Teñir con 3 gotas de eosina y dejarlo por 1 minuto
Deshidratar
Lavar con alcohol del 96 por escurrimiento
Lavar con alcohol absoluto del mismo modo
Lavar con alcohol absoluto-xilol (escurrimiento)
Transparentar
Depositar en xilol por 5 minutos
Montar
Para conservar la muestra se adiciona una gota de resina y el cubreobjetos
Dejar secar por 24 horas


7 Observación microscópica