Son los procedimiento empleados para analizar un organismo y sus caracterisiticas microscópicas con ayuda del microscopio
Para su relización se deben cumplir ciertos pasos los cuales son
- Obtención de muestra
- Fijación
- Lavado
- Obtención de corte
- Tinción
- Observación al microscopio
1 Obtención de muestra
Biopsia: Es la extracción de un muestra de tejido de un ser vivo para ser analizada al microscopio
Biopsia: Es la extracción de un muestra de tejido de un ser vivo para ser analizada al microscopio
Clasificación
Esta técnica puede obtenerse una muestra de dos maneras por incisión y excisión
Incisión: Solo tomar una parte del tejido dañado
Excisión: Tomar o retirar todo el tejido dañado
Tipos
Asi mismo existe diferentes tipos de biopsia
Endoscópica: Introducir una cámara por vía oral para revisar la morfología de los órganos
Médula ósea: Extracción de tejido de vertebras, esternón o de los iliacos
Perforación: Es una perforación de hueso
Raspado: También se realiza en el hueso pero haciendo un raspado
Punción: Introducir una aguja en un vaso sanguíneo para extraer una muestra de tejido (sangre)
Aspirado: Extracción de muestra líquida por medio de una succión, se emplea en caso de trastornos alimenticios pues sirve para diagnosticar anemia megaloblástica o cuando hay sospechas de leucemia (cáncer de sangre)
Aquí se usa una aguja llamada aguja de mandril que tiene la capacidad de atravesar piel, musculo y hueso
Con el se puede hacer un frotis
Impronta: Estudios citológicos que permite la visualización de células sanguíneas, consiste en frotar el tejido o muestra sobre portaobjetos logrando asi separar y aislar las células, para su observación al microscopio
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2 Fijación
Es el detenimiento de toda actividad celular para mantener todas las estructuras morfológicas sin cambios y asi todo lo que se vea, sea normal
Si no se hiciera podría la muestra recibir de daños como:
Autolisis: Destrucción de células por acción enzimática causadas por las propias células y sin acción bacteriana
Putrefacción: destrucción de tejidos por acción bacteriana
Tipos de fijación
Fijadores Físicos
Calor: Consiste en pasar un portaobjetos por el fuego y para que las bacterias no puedan adherirse
Congelación: Sirve para muestras de obtención rápida
Fijadores químicos
Son todos aquellos que su origen sea químico (reactivos)
Fijación por coagulación de proteínas: Mantienen la morfiología y las grasasEl ejemplo mas comun es el formaldehido
Fijación por precipitado de proteínas: Este tipo de método causa artefactos que afecta la observación al precipitarse forma un cúmulo sobre células generando un mazacote anormal que se ven como manchas y evita la observación de los nucléolos
Clasificación de fijadores químicos
Se clasifican en fijadores simples y compuestos
Simples
Son todos aquellos que están conformados por un solo fijador
Ejemplos
- Formaldehido al 10%
- Alcohol etílico
- Metanol
- Tetróxido de osmio
- Bicloruro de mercurio
Compuesto
Mezcla de 2 o mas fijadores químicos simples
Ejemplos
- Bouin*
- Zenker
- Flemming*
- Helly
- Heidenhein*
* Los mas usados
Cualidad de los fijadores
- Actuan con rapidez
- No crean artefactos (coagulador de proteínas)
- Tienen poder de penetración y difusión
- Producen dureza sin hacer quebradiza o retrae la muestra
- No interfiere en la coloración u otros pasos de la técnica histológica
- No debe ser tóxico
- Debe ser económico
Criterios
- Tamaño de la muestra: 2 cm x 5 mm de espesor
- Volumen fijador que abarque 10 veces la muestra
- Tiempo de fijación de 1 semana como mínimo
- Temperatura de la fijación
- Almacenamiento de la muestra
3 Lavado del fijador
Se lava con agua para quitar la grasa y se suspende en un vaso, el agua no debe ser a mucha presión
4 Obtención de corte
4.1 Congelación
4.2 Inmersión en parafina
4.1 Congelación
Se realiza con ayuda de un criotomo un aparato que tiene la capacidad de realizar cortes finos
Procedimiento
Para congelarse requiere de algun material que ayude a su congelamiento entre los que puede estar
- Anhídrido carbónico comprimido
- Isopentano
- Dióxido de carbono
A una temperatura de entre -20 y 30°C
Propiedades
- Conserva lípidos, proteínas (como las enzimas)
- Cortes gruesos (de entre 20 a 30 micras)
- No se usa para morfología sino para ver el tejido de la muestra
- Es una técnica rápida
- Hace cortes completos o no seriados
Criostato
Es un aparato que se podría decir tiene un criotomo adentro, es la evolución del criotomo, es por eso que es el que se usa en laboratorios de patología
El criotomo tiene como desventaja el generar cristales los cuales rasgan los tejidos además de que dichos cristales son visibles en el microscopio, es por eso que el criostato tiene una sustancia crioprotectora que evita la formación de estos cristales (la sustancia puede ser isopentano o anhídrido carbónico
También es posible obtener cortes de 2 micras de grosor
Ventajas
- Conserva lípidos, proteínas y enzimas
- Utiliza poco material
- Es de rápido diagnóstico
- Es barato
- No requiere fijador
- Facil de manipular el grosor
- Requiere poco material
- Tiene muchas veces una navaja permanente que debe dársele mantenimiento
- Utiliza materiales no tóxicos
Desventajas
- No se conserva la morfología microscópica
- (En el criotomo) genera cristales que rasgan las células
- Cortes no seriados, lo cual hace imposible detectar el nivel de daño en los tejidos
- Son preparaciones temporales
4.2 Inclusión en parafina
Para su realización se requiere de un microtomo
Se usa la parafina para que la muestra adquiera dureza y asi poder hacerle cortes
Procedimiento
- Deshidratación
- Impregnar en un solvente de parafina (xilol)
- Inclusión en parafina (preliminar)
La parafina se encuentra normalmente en estado sólido, y como se requiere usar en un estado líquido esta se manda a fundir, es por esto y otras razones que se hace uso de una estufa que esta a 60°C
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En esta estufa se encontraran 4 recipientes de aluminio rotulados como Parafina 1, Parafina 2 parafina 3 y parafina de inclusiónLa muestra se pondra sobre Parafina 1 durante 2 horas, luego en Parafina 2, Parafina 3 y parafina de inclusión sucesivamente por 2 horas en cada recipiente
Quitar el agua que contiene con ayuda de diferentes concentraciones de alcohol
Sumergir alcohol
a) Al 50% por 2 horas
b) Al 60% por 2 horas
c) Al 70% por 2 horas
d) Al 80% por 2 horas
e) Al 96 % por 2 horas
f) Absoluto (100%) por 2 horas
g) Alcohol absoluto con Xilol por 2 horas
Este procedimiento se hace con la finalidad de que se vayan adaptando las células y no sufran cambios bruscos
Se pone en una solución xilol por otras 2 horas
Observación: El xilol es una sustancia cancerígena tóxica y con olor penetrante
Los órganos se van a volver translucidos y permitirá que la parafina entre en contacto con las células
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4. Inclusión definitiva de parafina
Con ayuda de una solución de alcohol con glicerina en cantidades iguales, con una gaza se sumerge en esta solución y se barniza las paredes del molde (las pinzas con las que se debe tomar la gaza deben estar calentadas.
Luego de haber puesto la parafina 3 en el de inclusión y de haber esperado el tiempo adecuado se pone la parafina en el molde hasta la mitad, posteriormente se pone la muestra y terminar d exponer parafina hasta el borde y se deja solidificar por 10 minutos o se pueden poner sobre una cubeta de agua para acelerar su solidificación
Histokinet
Es un equipo automatizado con recipientes de metal y vidrio en donde van soluciones de alcohol para deshidratar la muestra
En los de metal son los que se usan para fundir la parafina
Caracteristicas de la técnica de corte
- Cortes seriados
- Destruye los lípidos, ya que estos se disuelven en el alcohol
- Se debe usar un portaobjetos como sostén de la muestra y para adherirlo a este debe de hacerse un baño de flotación de tejido a 15-20°C
- Se puede usar grenetina o albumina como pegamento
- Se le ponen gotas de xilol y se sumerge
- Se escurre el exceso
- Se pone en charola para seca y luego en una canastilla
- Y llevarla nuevamente al horno de 60°C por 4 horas para quitar el sobrante de parafina
- Se sacan las laminilla a enfriar y se guardan en una caja de portaobjetos
Ventajas
- Cortes finos
- Permanente
- Mejor diagnostico
- Conserva proteínas y enzimas
- Cortes seriados
- Navajas desechables
- Preparación permanente
Desventajas
- Muy tardado
- No conserva lípidos
- Reactivos tóxico y caro
- Manipulación compleja
- Antes de teñirse debe desparafinarse por 30 minutos
Conclusión
Si se quiere ver la morfología debe de usarse parafina, pero si se quieren ver lípidos o proteínas se usa congelación
5. Coloración
Procedimiento en el que se le da color a través de una sustancia llamada colorante. Estas sustancias tienen la capacidad de fijar estructuras de los tejidos y permite distinguir estructuras invisibles o de poca visibilidad
Clasificación
Origen:
Naturales, proviene de una fuente natural
>Vegetal
>Animal
Artificiales, colorante de síntesis química derivados de anilina
Para hacer una coloración se recurre a un tren de coloración el cual es una fila de reactivos acomodados en su orden de uso para la realización de la tinción, y estos están sobre un mantel blanco
Colorante
Son sales formadas por un cromógeno y un auxocromo
El cromógeno es el que aporta el color según sea la carga (+) o (-), si el cromógeno es de carga (+) teñirá estructuras de carga (-) como el núcleo (ADN, ARN, glicosaminoglicanos), pero si es de carga (-) teñirá estructuras de carga (+) como la estructuras protectoras o citoplasma
Por otro lado el auxocromo es que facilita la unión del cromógeno con el tejido, sin auxocromo no hay tinción
Tipos de colorantes
Básicos o nucleares
Cromógeno de carga(+) que tiñen estructuras de carga (-)
 |
| La hematoxilina es un colorante básico, por eso es capaz de teñir los núcleos pues estos son de carga negativa |
Ácidos o citoplasmáticos
Cromógeno de carga (-) que tiñe estructuras de carga (+), requiere colorante de contraste
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| El citoplasma de las células epiteliales es de carga positiva |
Neutros
Cromógenos con cargas positivas y negativas, con capacidad para aportar color
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| La tinción de Wright es un ejemplo |
Indiferentes
Son aquellos que no son ni ácidos ni bases y no se unen a los elementos de los tejidos por afinidad química sino que se disuelven en ellos
Clasificación de los colorantes
Topográficas: Teñido intenso del núcleo y débil del citoplasma o fuerte fuerte coloración en ambas
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| La técnica hematoxilina eosina es un ejemplo |
Directa: Por inmersión en el colorante, con solo añadir una gota de colorante es suficiente para teñirse por su afinidad estructura-colorante (auxocromo)
La eosina es un ejemplo de este tipo
Indirecta: No hay afinidad entre el tejido y el colorante (ausencia de auxocromo), es por eso que debe tratarse con un mordente el cual hace la función de auxocromo. Por lo general se usa el tritrocloruro férrico
Progresivas: Cuando el tejido adquiere lenta y gradualmente el grado de color adecuado, es decir, se va tiñendo poco a poco
La hematoxilina-eosina entra en esta categoría igual
Regresivas: El corte sobre teñido debe sufrir una diferenciación, cuando se utiliza un colorante por lo general tiñe todas le estructuras, es por eso que deben de usarse ciertas sustancias (soluciones ácidas o alcohólicas) que eliminen el colorante excedente de las estructuras en las que no debería estar, estas soluciones generalmente dan otra coloración y es por eso que debe dársele otra tinción
En la tinción de hematoxilina-eosina primero se pone la hematoxilina y posteriormente de la hace una diferenciación para asi pasar a usarse la eosina
Ortocromáticas: Son las que toman el color del colorante
Metacromáticas Son las que toman un color diferente al colorante
En algunos tejidos como el cartílago cuando se usa técnica de azul de toluidina las células son capaces de alterar las frecuencias de onda del colorante adoptando asi otros colores
Procedimiento para tinción hematoxilina eosina
- Desparafinar
- Hidratar
- Tinción
- Deshidratar
- Transparentar
- Montar
Se pone en xilol 5 minutos
Se trasporta la muestra en alcohol absoluto con xilol por otros 5 minutos
Introducir la muestra en alcohol absoluto otros 5 minutos
Pasar a alcohol del 96% nuevamente por 5 minutos
Colocar en alcohol del 70% (5 minutos)
Hidratar en agua corriente (mínimo 5 minutos)
7 Observación microscópica
teñir con 3 gotas de hematoxilina de Harris y dejarlo por 5 minutos
Lavar la muestra por inmersión en agua
Diferenciar con alcohol acido. Dejarlo hasta notar que la muestra se torna de naranja y retirarlo rápida e inmediatamente
Lavar con agua otra vez
Se debe virar el pH con agua amoniacal, dejándolo hasta que se vea la muestra de color azul
Teñir con 3 gotas de eosina y dejarlo por 1 minuto
Lavar con alcohol del 96 por escurrimiento
Lavar con alcohol absoluto del mismo modo
Lavar con alcohol absoluto-xilol (escurrimiento)
Depositar en xilol por 5 minutos
Para conservar la muestra se adiciona una gota de resina y el cubreobjetos
Dejar secar por 24 horas